Q：親和層析定義：

A：生物(wù)分(fēn)子間存在很(hěn)多(duō)特異性的相互作(zuò)用(yòng)，如我們熟悉的抗原－抗體(tǐ)、酶－底物(wù)或抑制劑、激素－受體(tǐ)等等，它們之間都能(néng)夠專一而可(kě)逆的結合，這種結合力就稱為(wèi)親和力。親和層析的分(fēn)離原理(lǐ)簡單的說就是通過将具(jù)有(yǒu)親和力的兩個分(fēn)子中(zhōng)一個固定在不溶性基質(zhì)上，利用(yòng)分(fēn)子間親和力的特異性和可(kě)逆性，對另一個分(fēn)子進行分(fēn)離純化。被固定在基質(zhì)上的分(fēn)子稱為(wèi)配體(tǐ)，配體(tǐ)和基質(zhì)是共價結合的，構成親和層析的固定相，稱為(wèi)親和吸附劑。親和層析時首先選擇與待分(fēn)離的生物(wù)大分(fēn)子有(yǒu)親和力物(wù)質(zhì)作(zuò)為(wèi)配體(tǐ)，例如分(fēn)離酶可(kě)以選擇其底物(wù)類似物(wù)或競争性抑制劑為(wèi)配體(tǐ)，分(fēn)離抗體(tǐ)可(kě)以選擇抗原作(zuò)為(wèi)配體(tǐ)等等。不同生物(wù)對之間結合的特異性盡管存在高低差異，但它們之問都能(néng)夠可(kě)逆地結合和解離，可(kě)由此進行蛋白質(zhì)、多(duō)糖、核酸或細胞的分(fēn)離和純化。

Q：凝膠過濾層析定義：

A：凝膠過濾介質(zhì)都是具(jù)有(yǒu)三維網狀結構的顆粒，當顆粒狀介質(zhì)填充成層析柱時，在顆粒間存在大量間隙，隻有(yǒu)直徑小(xiǎo)于顆粒網孔孔徑的分(fēn)子能(néng)夠進入凝膠顆粒内部，無法進入凝膠顆粒内部的分(fēn)子将從間隙中(zhōng)通過。因此，凝膠過濾分(fēn)離的原理(lǐ)可(kě)簡單認為(wèi)是不同的溶質(zhì)因不同程度進入介質(zhì)而在液相中(zhōng)停留的時間不同，凝膠的孔徑和溶質(zhì)分(fēn)子大小(xiǎo)的關系決定了層析時該物(wù)質(zhì)在層析柱中(zhōng)的保留時間，不同的物(wù)質(zhì)因保留時間不同而分(fēn)離。

Q：離子交換層析定義：

A：待分(fēn)離物(wù)質(zhì)在特定條件下與離子交換劑帶相反電(diàn)荷因而能(néng)夠與之競争結合，而不同的分(fēn)子在此條件下帶電(diàn)荷的種類、數量及電(diàn)荷的分(fēn)布不同，表現出與離子交換劑在結合強度上的差異，在離子交換層析時按結合力由弱到強的順序被洗脫下來而得以分(fēn)離。蛋白質(zhì)、多(duō)肽、核酸、聚核苷酸、多(duō)糖和其他(tā)帶電(diàn)生物(wù)分(fēn)子正是如此通過離子交換劑得到了分(fēn)離純化，即帶負電(diàn)荷的溶質(zhì)可(kě)被陰離子交換劑交換，帶正電(diàn)荷的溶質(zhì)可(kě)被陽離子交換劑交換。

Q：疏水層析定義：

A：蛋白質(zhì)和多(duō)肽等生物(wù)大分(fēn)子的表面常常暴露着一些疏水性基團，疏水性基團可(kě)以與疏水性層析介質(zhì)發生疏水性相互作(zuò)用(yòng)而結合。不同的分(fēn)子由于疏水性不同，它們與疏水性層析介質(zhì)之間的疏水性作(zuò)用(yòng)力強弱不同，溶液中(zhōng)的高離子強度可(kě)以增強蛋白質(zhì)或多(duō)肽等生物(wù)大分(fēn)子與疏水性層析介質(zhì)之間的疏水作(zuò)用(yòng)。利用(yòng)這個性質(zhì)，在高離子強度下将待分(fēn)離的樣品吸附在疏水性層析介質(zhì)上，然後通過線(xiàn)性或階段降低離子強度選擇性的将樣品解吸。疏水性弱的物(wù)質(zhì)，在較高離子強度的溶液時被洗脫下來，當離子強度降低時，疏水性強的物(wù)質(zhì)才随後被洗脫下來。

Q：如何判斷填料壽命已經到了？

A：當發現填料在經過CIP、再生後，不能(néng)使填料恢複原本的顔色、緩沖液流經速度明顯下降、樣品挂柱效果出現一定程度下降，或者純化出的樣品純度開始下降時，就要更換填料了。為(wèi)提高填料使用(yòng)壽命，請在上樣前務(wù)必對填料進行澄清處理(lǐ)，并在使用(yòng)結束後及時CIP并采用(yòng)推薦的儲存條件進行儲存。

Q：Ni 柱進行蛋白純化需要注意什麽?

A：緩沖液中(zhōng)不能(néng)有(yǒu)高濃度的電(diàn)子供體(tǐ)基團、不能(néng)有(yǒu)強螯合劑、不能(néng)有(yǒu)高濃度強還原劑、不能(néng)含離子型去垢劑、避免含碳酸氫鈉等物(wù)質(zhì)。

Q：GST 蛋白純化需要注意什麽？

A：避免蛋白樣品超聲太劇烈或時間過長(cháng)引起的蛋白變性，增加洗脫緩沖液的 pH 值可(kě)在不增加還原谷胱甘肽濃度的情況下提高洗脫效率。

Q：抗體(tǐ)純化時需要注意什麽？

A：(1)介質(zhì)的選擇A,G or 其他(tā)，其結合能(néng)力的選擇；(2)上樣流速盡量小(xiǎo)（一般保留時間為(wèi)4-6min為(wèi)宜），讓Protein A和抗體(tǐ)有(yǒu)充分(fēn)的結合時間；(3)在低pH值洗脫後，快速中(zhōng)和；(4)長(cháng)時間保存樣品加入0.02-0.05％疊氮鈉；(5)加入10%甘油，可(kě)有(yǒu)效防止疏水作(zuò)用(yòng)引起的聚集；(6)抗體(tǐ)純度不夠，雜蛋白含量高，易引起蛋白的沉澱。。

Q：層析柱填料體(tǐ)積的計算公(gōng)式？

A：層析柱的底面積*高。

Q：瓊脂糖磁珠中(zhōng)氧化鐵的直徑是多(duō)少？

A：約400-500nm。

Q：連接抗體(tǐ)的瓊脂糖磁珠相較于直接連接抗體(tǐ)的磁珠有(yǒu)何優勢？

A：瓊脂糖基質(zhì)具(jù)有(yǒu)非常好的親水性和載量，非特異性吸附作(zuò)用(yòng)極低，并且可(kě)以通過磁吸分(fēn)離純化微量蛋白。

Q：純化蛋白時所需的緩沖液PB代表什麽？

A：鈉的磷酸鹽，按照一定的比例配置成不同pH的溶液。

Q：預活化介質(zhì)為(wèi)什麽要在100%有(yǒu)機溶劑中(zhōng)低溫保存？

A：低溫的目的是為(wèi)了防止活化基團降解；預活化層析介質(zhì)的配基比較活潑，不能(néng)長(cháng)時間接觸水否則會分(fēn)解，所以選擇100%有(yǒu)機溶劑中(zhōng)保存（一般情況保存在異丙醇、丙酮中(zhōng)）。

Q：強離子交換與弱離子交換有(yǒu)什麽差别？

A：強離子交換與弱離子交換的差異在于強的為(wèi)完全電(diàn)離，弱的為(wèi)部分(fēn)電(diàn)離。強的在較寬的 pH 範圍内有(yǒu)着比較好的載量，而弱的會随 pH 的不同結合的強度與載量有(yǒu)改變，所以，能(néng)提供更多(duō)的選擇性。一般推薦先嘗試強離子交換，在選擇性不好的時候可(kě)以再嘗試弱離子交換。

Q：關于 NHS 和 CNBr 的選擇？

A：CNBr 與 NHS 預活化填料最主要的區(qū)别是：NHS 預活化填料的反應位點與填料基架之間有(yǒu) 10或 14個原子的間隔臂，而 CNBr 則沒有(yǒu)。對于小(xiǎo)分(fēn)子配基（< 5 KD），當配基和樣品結合的時候，由于 CNBr 沒有(yǒu)間隔臂，可(kě)能(néng)會由于空間位阻而影響結合，在這種情況下，建議使用(yòng) NHS 活化配基填料。對于大于 5KD 的配基，二者差異不大。

Q：不同樣品檢測的吸光度值？

A：蛋白樣品最大吸收值一般在 280 nm，核酸或病毒在 254 nm 或 260 nm；多(duō)肽 215 nm；多(duō)糖 206 nm。

Q：柱子有(yǒu)色素如何去除？

A：色素性質(zhì)很(hěn)複雜，可(kě)以根據填料的耐受情況，優先嘗試 NaOH 清洗，另外，也可(kě)以使用(yòng)有(yǒu)機溶劑（如 30% 異丙醇或乙醇），最後再嘗試酸，如 0.01 M HCl。如果去除不掉，可(kě)以定期把色素污染部分(fēn)的填料去除。

Q：柱高不變，直徑由1.6cm放大到比如20cm，柱壓會增大多(duō)少？

A：層析放大的原理(lǐ)為(wèi)直徑放大，柱高不變（即線(xiàn)性流速或保留時間不變）。在放大時層析柱的分(fēn)配器，以及篩闆設計非常重要。設計優異的層析柱柱壓一般不會增大。

Q：Protein A和Protein G兩種介質(zhì)在純化抗體(tǐ)有(yǒu)何區(qū)别，結合位點各有(yǒu)幾個？

A：protein G 的結合位點：Protein G與Ig G的Fc結合，同時也可(kě)以結合IgG CH1區(qū)域。此配基為(wèi) 17KD， PI 4.1. 在全抗體(tǐ)或Fc融合蛋白的純化中(zhōng)由于Protein A 層析介質(zhì)的載量高于Protein G，所以一般使用(yòng)Protein A層析介質(zhì)。ProteinＡ的結合位點：與IgG結合的亞類主要是IgG1、IgG2和IgG4。Protein A與抗體(tǐ)IgG 結合有(yǒu)兩個區(qū)域,Fc 與Fab。主要與Fc的CH2,CH3 結合的是Protein A 的B，與Fab 結合位點是VH3。

Q：線(xiàn)性洗脫會有(yǒu)什麽樣的問題？

A：線(xiàn)性洗脫較好的分(fēn)離方法，優點：高分(fēn)辨率；缺點：樣品濃度相對低，操作(zuò)時間長(cháng)，需要雙泵系統。步梯度洗脫，優點：操作(zuò)時間短，樣品濃度高，但是分(fēn)辨率低。

Q：抗體(tǐ)的等電(diàn)點能(néng)否用(yòng)生物(wù)信息學(xué)的方法預測，消光系數怎麽計算？

A：一般預測的軟件得到的一些參數不是很(hěn)準确，不同的表達系統，不同的培養方法，所得到的等電(diàn)點不同。所以隻能(néng)參考。

Q：蛋白質(zhì)聚集在柱子上？

A：通過調整層析過程中(zhōng)的緩沖液來增加蛋白質(zhì)的穩定性，改善蛋白質(zhì)在層析柱上的狀态。當堆積在層析柱上時，需要用(yòng)CIP清洗層析柱。

Q：結合緩沖液不合适，柱子平衡不好？

A：調整緩沖液，例如金屬螯合介質(zhì)與His-tagged蛋白結合時，pH值應在7.3-8.5之間。肝素親和介質(zhì)與DNA聚合酶結合時，鹽濃度過高影響結合，應控制在50mM以下。色譜柱平衡不好。柱床系統中(zhōng)的環境也會影響結合。色譜柱在上樣前必須完全平衡。

Q：如何去除樣品中(zhōng)的 DNA/RNA等核酸雜質(zhì)污染？

A：延長(cháng)超聲時間以降低粘度。也可(kě)以使用(yòng)核酸酶如 Benzonase同時消化 DNA和 RNA。如果來源是大腸杆菌裂解液，含有(yǒu)大量的DNA，可(kě)以用(yòng)鏈黴素沉澱等方法，預先去除大量的 DNA。

通過層析方法去除 ：由于核酸帶負電(diàn)，在陰離子柱上會結合或陽離子柱上流穿，也可(kě)以有(yǒu)效去除核酸。去除填料上結合的核酸 ：一般采用(yòng) 1M NaOH + 1M NaCl對核酸的去除效果較好(需要确認填料是否可(kě)耐受NaOH)。如果核酸的吸附過強，會采用(yòng)強烈的方法，3M氯化鈉去除靠靜電(diàn)吸附的核酸，然後用(yòng) 1M的氫氧化鈉分(fēn)解核酸，之後再用(yòng) 3M NaCl清洗。

Q：柱子進氣泡或跑幹了，怎麽辦(bàn)？

A：可(kě)能(néng)的原因 ：環境溫度變化 ；緩沖液未經過脫氣 ；層析柱連接系統或操作(zuò)不當。

建議處理(lǐ)方法 ：用(yòng)大量脫氣去離子水或 20%乙醇反向高速沖洗層析柱，直到小(xiǎo)氣泡被帶出 (沖洗過程建議在系統連接反壓閥之後進行) 。如果大量進氣，建議重新(xīn)裝(zhuāng)柱。